鼠疫叶氏杆菌又名鼠疫杆菌,为卵圆形,无特殊构造的革兰染色阴性杆菌。在肉汤中繁殖呈链状,在3%氯化钠琼脂上生长形成多形性菌体。鼠疫菌形态学检查一般用碱性美兰作单染色,菌体两端染色深,中间几乎不着色。
图1 感染小鼠脾脏压片中的鼠疫杆菌
在感染动物脏器压片中细菌的形态呈多形性。如图1。
鼠疫菌在普通营养琼脂上可生长。最适培养温度为28~30℃。在琼脂培养基上培养16~18小时,用低倍显微镜可见碎玻璃样的微小菌落,经24~48小时形成肉眼可见的菌落,在放大镜下观察,菌落中心凸起,四周有菲薄的边缘,形如“钢盔”或“荷包蛋”。在亚硫酸钠(0.05%)溶血(0.1%)赫氏琼脂上生长较快,但菌落偏于光滑,薄边狭窄,难于和假结核杆菌区别。鼠疫菌落有粘性,可用接种环在琼脂表面上完整地推移,此特征有助于分离培养时挑选可疑菌落。菌落特征如图2、3。
图2 鼠疫杆菌菌落40×透过光(龙胆紫、亚硫酸钠溶血琼脂28℃ 72小时)
图3 鼠疫杆菌菌落20×投射光(普通营养琼脂28℃72小时)
鼠疫噬菌体裂解试验,可与分离培养同时进行,如标本中含鼠疫菌量大(如自毙疫鼠的肝、脾)有快速诊断的意义。鼠疫菌噬菌体在37℃培养时可以裂解假结核杆菌,在15℃~20℃的温度范围培养对假结核菌无作用,对鼠疫杆菌仍能裂解。但须注意,假结核杆菌的噬菌体只在37℃培养时裂解假结核菌,对鼠疫杆菌不论在37℃或在15℃都有裂解作用。
对鼠疫杆菌的敏感试验动物是小鼠和豚鼠。小鼠对鼠疫菌的毒性物质敏感,如标本中含量大时可使小鼠在24小时内死亡。剖检时看不到特殊病理变化。豚鼠对毒素不敏感,是鼠疫菌的可靠试验动物。经皮下接种,可见试验动物的接种局部组织粘连,鼠蹊淋巴结肿大,周围组织充血或有血性浸润。肝、脾肿大有粟粒样化脓点,或有斑纹状坏死病变。动物多死于接种后5~7天。当标本腐败或含菌量大时,可用豚鼠擦皮法,即将接种局部拔毛后,用刀片刮皮肤至有轻微伤痕,再用棉签蘸接种材料悬液在划痕处反复涂擦,此法可起滤除杂菌的作用,成功地分离出鼠疫杆菌。
荧光抗体,反向间接血球凝集法和炭血清法,可用于鼠疫杆菌的快速检验,三种方法配合使用,检查含鼠疫杆菌的外界标本,可以提高检出率。但必须用37℃培养形成荚膜的鼠疫菌作抗原免疫动物,制备的抗荚膜血清。抗菌体血清和假结核杆菌有交叉反应。根据形态、菌落、噬菌体和对小鼠或豚鼠的致死性和病理改变就可作出确定诊断。如有临床症状或病理改变为参考的新鲜标本,由形态特征或荧光抗体染色的结果即可作出比较准确的初步诊断。
鼠疫杆菌从三十年代起就被日军选为战剂。1940年日军“731”细菌部队已具有月产300kg乳浆状浓稠鼠疫菌液,200kg跳蚤的生产能力并用于实际侵华战争。美军侵朝战争中曾以和日军同样的方式使用鼠疫杆菌对中、朝进行生物战。“调查在朝鲜和中国的细菌战事实,国际科学委员会报告书及附件”中记载了如下主要史实:即第二次世界大战期间日本在宁波和常德等地使用了带鼠疫菌的跳蚤,1940年于宁波城区发生鼠疫病人99名,死亡98名。
1952年美军于朝鲜北部的安州等六个郡投撒跳蚤,经细菌学家检查证明有鼠疫杆菌,在安州地区一个600居民的村子有53人染病,36人死亡。
从五十年代开始,适应生物武器的发展趋势,国外对鼠疫杆菌气溶胶也进行了研究。强毒鼠疫杆菌气溶胶的半数致死量如表1所示。
鼠疫杆菌混悬液雾化形成气溶胶后回收率很低,
表1 鼠疫杆菌呼吸道感染LD50菌数
攻击对象 | (个菌) | 数据来源 | 年份 |
小鼠 | 4~5×103 | L.J.Goldberg | 1954 |
豚鼠 | 7.5×103 | H,A.Druettetal | 1956 |
猴 | 2.0×104 | R,S.Specketal | 1957 |
* 为由动物实验室感染肺鼠疫推测的数据。
** 为估计数字。 H. Wolochow (1957)等作13次毒菌试验,总回收率为5.2%(±2.1%)。形成气溶胶后的衰亡较快,该氏用鼠疫杆菌A-1122株测定的回收率如表2所示。表2 鼠疫杆菌A-1122株不同时间的气雾回收率
时间 | 原悬液,菌数/ml | 实际气雾,菌数/ml | 回收率 |
0 | 2.7 | 14.0 | 7.4 |
鼠疫杆菌形成气溶胶后随时间的延长对豚鼠呼吸道感染的毒力也有所下降,据R. J. Gooldav等人三次实验的平均值,形成气溶胶5分钟时,豚鼠吸入9.3×104个菌体细胞可引起96.6%的动物死亡,形成气溶胶45分钟时吸入12×104个菌体细胞只能引起20%的动物死亡。
能否使用鼠疫杆菌气溶胶进行生物战及其效应没有确切的根据。世界卫生组织顾问组(1970)对此作为假设进行了估计:①鼠疫杆菌对人类的ID50为104个细菌。②在夜间0~20℃、RH大于65%的条件下,其K值为0.02(即气溶胶的衰亡率为2%/min)。③单个轰炸机的攻击可能产生的原始效果,如污染面积在城市中心上风向1km,下风向9km,宽约2km,在无防护条件下对发达国家的50万居民可造成1.3%的人死亡,发展中国家可造成11%的人死亡。对发达国家的500万居民可造成0.72%的人死亡,对发展中国家可造成0.82%的人死亡。对后者如将继发病例估计在内,可能引起25万人死亡。
尽管鼠疫杆菌是曾被使用过的生物战剂,但在近期的美军手册中并未作为可以确定生产和使用程序的生物战剂,分析其原因可能是:①用带菌蚤撒布鼠疫杆菌其效应受到限制,因为跳蚤的活动范围小,容易发现和防护。②鼠疫杆菌气溶胶不稳定,而且尚未解决本菌不耐受雾化的问题。③鼠疫杆菌的感染力强,即所谓有强的向后性,使用一方难于控制其作用范围,不能保证自己不受其害。
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