杀菌试验是测定消毒剂性能的重要试验之一。早于1881年，Koch即提出将染有细菌的丝线浸于消毒剂中以测定其杀菌所需浓度与时间。1903年，Rideal与Walker设计苯酚系数测定法以进行消毒剂杀菌性能的对比，其原则一直沿用至今。对于表面、空气、水等不同对象的消毒效果测定方法，常随具体情况与需要安排，影响结果的因素又较多，故尚无较统一的试验方法。
目前，通用杀菌试验法仍是常规培养测定微生物死活。常规培养需较长时间才可获得结果，对消毒工作甚为不便。近年，曾证实以放射性同位素标记、荧光染色或酶活性显色测定等法可迅速判断微生物存活，为今后杀菌试验的改进提供了线索。
消毒剂杀菌试验方法较多，其步骤可归纳为：布置染菌样本(或利用自然污染条件)，进行消毒处理，采集样本，中和残余消毒药物，进行微生物学检验，计算消毒效果等六个环节。试验时，应严密控制可影响杀菌效果各因素，以使达到良好的可重复性。如菌种选择、样本制备、周围环境、残余药物中和以及接种与培养方法等等皆需给以具体规定。
试验用菌种，一般应易于培养，形态典型，无毒或弱毒，抗力稳定并略强于所代表的病原微生物。微生物于同种异株间的抗力常有所不同，为便于对比，试验中宜固定使用同一菌株。目前，各家选择菌株标准不同，使用菌株亦多不一致，有待逐步统一。
杀菌试验可直接于菌悬液中进行，亦可将微生物染于载体上进行。消毒剂对各种表面消毒难易不同，故多选最难消毒表面进行系统试验。光滑表面载体常以金属或玻璃为代表，粗糙表面载体常以布或纸为代表。载体多为片状或小管状，大小各家规定不一。布、金属、玻璃等载体应经脱脂后使用。染菌可用喷雾、浸泡、滴加等法。一般，每个样本回收菌数应介于105～106之间，彼此相差不宜超过2～5倍。
消毒剂浓度高时有杀菌作用，浓度降至一定程度即仅具抑菌作用或完全失去抗菌作用。对消毒剂试验浓度的选择，应考虑此特点。消毒的作用时间，如规定过长，可增加试验困难，并使结果失去实用价值;过短，则难达消毒要求，并易使试验产生误差。此外，相对湿度可影响气体或烟雾消毒剂的杀菌作用; 酸碱度可影响液体消毒剂的杀菌作用; 而温度则对所有消毒剂的杀菌作用都有明显影响，往往几度之差即可使死亡菌数发生对数级的改变。对与此类影响因素有关的条件，均应根据情况给以适当规定，并于试验中力求准确、稳定。
为防止残余药物抑制微生物生长而导致错误结果，试验时应去除消毒后样本中的残余作用因子。常用方法，一为物理去除法，即利用吸附、水洗、稀释、连续转种等法将残余药物去除或稀释至不足以产生抑菌作用的浓度;一为化学中和法，即利用酸碱中和反应、阴阳离子反应、或氧化还原反应等以使残余药物失去杀菌作用。如含氯消毒剂可用硫代硫酸钠中和; 汞类消毒剂可用巯基醋酸盐中和;季铵盐类消毒剂可用吐温80加卵磷脂中和等等。
杀菌试验须设对照，以排除非实验因素干扰，正确判断结果。对照种类根据试验要求而定。试验菌对照系将对照组样本置于试验组相同条件下，但不经消毒处理，以观察试验菌在无消毒剂时生长是否正常，并与消毒组相比计算杀菌率;自然菌消毒试验时，可用消毒前采样对照代替试验菌对照。培养基对照系将试验用未种菌培养基置试验组同一温箱内培养，以观察所用培养基有无污染。中和剂对照系将染菌样本不经消毒药物作用，直接种入含中和剂培养基中，以观察中和剂对试验菌的影响。必要时，尚可设中和剂与消毒剂作用产物对照。经消毒剂作用的样本，种入培养基前，如须经其他方法处理，如稀释、转种、离心、过滤或加吸附剂、保护剂等，均应设未经消毒样本的相应对照，以观察该种处理方法本身对试验菌的影响。
微生物经消毒处理并去除残余药效后，须立即接种以观察存活情况。培养基为细菌、真菌提供复苏和生长条件，可直接影响试验结果，应选用得当。至于病毒，只有接种于活体组织内才可生长繁殖。消毒处理后存活的微生物，因已受损伤，故生长缓慢，培养时间可适当延长。判断消毒剂的杀菌效果，通常多用定性和定量两种指标。定性指标以样本经一定时间培养后，有无微生物生长来判断，不计其数量。如有生长定为阳性(+)，如无生长定为阴性(-)。此指标多用于灭菌效果与苯酚系数测定。定量指标系经活菌计数，测定各样本中存活微生物数，并按下式求其杀灭率：
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