采用离体培养细胞的方法，观察放射对细胞的效应。

离体细胞的生长 哺乳动物细胞在离体培养条件下，在培养瓶内呈单层细胞生长，可有两种情况： ①当培养瓶内细胞数尚不太多时，大部分细胞处于生长活跃阶段，细胞总数呈指数上升，称为指数生长期。②细胞经过活跃繁殖期后，在培养瓶的平面上达到饱和浓度，细胞总数处于基本平衡状态，只有少部分细胞处于增殖状态以保持相对恒定的细胞总数，绝大部分细胞均处于细胞周期内相对静止的G1期，称为相对密度生长期。处于这个时期的细胞群，十分类似整体内肿瘤细胞群的状态，因此，往往被用于进行与肿瘤有关的放射生物学研究。

细胞存活曲线 细胞存活曲线是用以观察照射对细胞增殖能力影响的定量方法。1956年Puck和Marcus研究应用射线对离体细胞克隆(Clone)形成的影响，观察照射剂量与细胞存活之间的关系。反映这种关系的曲线叫细胞存活曲线。可通过细胞存活曲线研究不同射线类型及剂量率对哺乳动物细胞的剂量效应、各种哺乳动物细胞的放射敏感性、不同条件或环境对细胞放射敏感性的影响、细胞增殖周期不同期细胞的放射敏感性以及各种药物对细胞放射敏感性的作用。尚可观察细胞放射损伤及修复。

放射治疗的目的是抑制肿瘤继续生长，阻止癌细胞繁殖后代。所以，放射生物学鉴别处于增殖状态的细胞是否存活的唯一标准是受照射后的细胞有否保留无限增殖能力。细胞受照射后，即使形态完整，表面无损伤，有能力制造蛋白质，但失去无限繁殖能力，不能产生大量子代细胞，都称为非存活细胞即细胞死亡;而保留繁殖能力，能无限地产生子代细胞，称为存活细胞。一个存活单细胞可分裂繁殖成为一个细胞群体，称为克隆或集落。具有生成克隆能力的原始细胞称为“致克隆性细胞”。这是指正处于增殖状态的细胞，如造血干细胞、肿瘤细胞、离体培养细胞等。对那些不再增殖的已分化细胞，如神经细胞、肌肉细胞等，只要丧失其特殊功能便是细胞死亡。

离体细胞存活曲线 将已培养成株的离体细胞制成单细胞悬液，用特定的培养液稀释成需要的浓度，取含有100个细胞的悬液种植到平皿内，补入适量的培养液，在37℃恒温、5%CO2的环境下培养2～3周。单个细胞贴壁、分裂、繁殖、长成克隆，经固定染色后观察克隆，计算含50个细胞以上的克隆数。由于各种因素影响，各种细胞株单个细胞形成克隆的能力在20～90%范围，是为该细胞株的克隆形成率(plate efficiency，PE)。对平皿内的单个细胞混悬液先分别给予不同剂量的照射，然后放入37℃恒湿恒温、5%CO₂的环境中，培养2～3周。可见有些细胞处于单个细胞状态; 有些细胞仅能进行1或2次分裂，形成很小的发育不全的集落;而有些细胞仍能生长成大克隆，即照射后仍保留了无限生殖能力。将受不同剂量照射后的存活细胞数和对照的克隆数相比较，即可得到该剂量照射后的细胞存活率。以照射剂量为横座标，细胞存活率为对数纵座标，可得到一条特定细胞株在特定条件下的细胞存活曲线。哺乳动物细胞的存活曲线是非指数性存活曲线。在较小剂量照射时，细胞并没有出现指数性死亡。因而曲线在开始时并非直线下降，而有一段较平坦部分，称之为肩区，随着照射剂量的增加，始出现细胞的指数性死亡。在有些特定条件下，某些细胞株也可能在整个曲线上没有直线部分。

哺乳动物细胞存活曲线的理论基础 细胞内的放射敏感区称为“靶”。一次打击不能使哺乳动物细胞死亡，多靶单击学说认为一个细胞内不是只有一个靶，而是有若干个放射敏感区。射线必须对每个靶打中一次，才能造成细胞的死亡。单靶多击学说认为细胞内只有一个放射敏感区，但这放射敏感区必须被多次击中，才能导致细胞死亡。任何一个学说都说明一个事实，即哺乳动物细胞必须受到射线多次打击才会死亡。存活曲线“肩区”的出现便是细胞群放射效应的表现。假设一个细胞内有n个靶，只有打击n个靶才能使细胞死亡;即使击中n-1个靶，细胞也不会死亡。在小剂量照射时，细胞内被击中的靶数不满n个。没有细胞死亡。剂量加大，个别细胞内n个靶都被击中出现死亡，但大部分细胞仍未开始死亡。此后，n个靶均被击中的细胞数量逐渐增多，曲线略有下降，直到尚未死亡的每个细胞都被击中n-1个靶时，肩区结束。从这以后更大的剂量，每击中一个靶便出现一个细胞的死亡。细胞存活率和剂量便呈指数关系，表现为曲线的直线部分。对有些没有直线部分或直线部分很短的存活曲线，只有解释为细胞内的靶数非常多，必须打击相当多次才能使细胞死亡。因此，随机分布的射线对靶的打击数，很难或永远不会达到每个细胞的靶都被击中n-1次的状态，只有在剂量相当大时才出现存活率和剂量呈指数性下降的现象，甚至根本不出现。

细胞存活曲线几个参数的生物学含义 ①平均致死剂量D₀： 反映细胞存活曲线直线部分的斜率。当射线对细胞的杀灭呈指数性关系时，D0代表杀灭63%细胞所需要的剂量，亦是细胞只剩37%存活的剂量。D0还反映细胞的放射敏感性。由于细胞在照射时或照射后环境的改变，可以使D₀值发生变化。②外推数N值： 将曲线的直线部分延长和纵轴相交，所截的部分为N值。反映细胞内的靶数或杀灭细胞所需要的打击次数。③准阈剂量Dq： 也可称为浪费的辐射剂量。将存活曲线的直线部分延长与横轴相交，所截部分为Dq。代表存活曲线的肩宽。表示照射达到使细胞呈指数性死亡的剂量中一部分不可避免的浪费剂量。在准阈剂量内细胞表现为亚致死损伤并能修复，即细胞所受的是n-1个靶的打击。④D₃₇在存活曲线的早期，以D₃₇表示平均致死剂量，即一个照射剂量使100%存活细胞群中，63%的细胞被杀死，尚有37%存活。在单靶单击的指数性存活曲线中D₃₇＝D₀，在肩区大的非指数性存活曲线中，D₃₇受其他参数干扰而失去意义，所以现在不用D37而用D0。⑤ D5为存活曲线肩区结束处 (指数性直线部分的开端处)和横轴的相交点。这能更好反映肩区的大小。⑥D^-2为使存活细胞从1降为10^-2的剂量(见图)。

体内细胞存活曲线 用存活曲线的形式表达在整体动物中不同细胞的放射剂量效应。①肿瘤细胞体内存活曲线： 对白血病小鼠给予不同剂量的照射。以不同浓度病鼠肝细胞混悬液注入受体小鼠，使一半小鼠染病的细胞混悬液浓度为TD50 (tumor dose 50%)，以求不同剂量照射的TD₅₀与未经照射的病鼠肝细胞悬液的TD₅₀比较，求得不同剂量的瘤细胞存活率，画出存活曲线。②小鼠皮肤存活曲线： 用X线一次3000rad对小鼠背部皮肤作一环形照射，造成环内表皮完整无损的皮肤小岛。对这些小岛给予不同剂量的照射，观察再生的皮肤结节。以每平方厘米皮肤存活细胞数为纵座标与以剂量为横座标画成小鼠皮肤存活曲线。③小肠隐窝上皮细胞存活曲线： 将小鼠一段小肠襻游离到体外，使其铺开成一半圆形肠襻，先使肠襻两端受3000rad照射，造成壕沟，使外面的细胞不能移行至肠襻中段。对不同肠襻给予不同剂量照射，观察13天后肠襻中段细胞结节的数量。纵座标为单位面积细胞集落数。④脾集落法： 用以在整体内测定造血干细胞的存活曲线。先使受体小鼠脾脏受900～1000rad照射，使其无再生能力。将受不同剂量照射的供体造血干细胞注入受体动物，过一定时间后，计供体造血干细胞在受体脾脏生长的集落数，算出干细胞的存活率，画出造血干细胞的存活曲线。

非指数性存活曲线中各种参数示意图